GLP-1(ลิงค์:HTTPS://www.BloomTechz.com/synthetic-Chemical/peptide/GLP-1-Peptide-CAS-87805-34-3.html) เป็นฮอร์โมนโพลีเปปไทด์ที่ประกอบด้วยกรดอะมิโน 30 ชนิด จากการวิจัยเชิงลึกเกี่ยวกับ GLP-1 ได้มีการพัฒนาวิธีการสังเคราะห์มากขึ้นเรื่อยๆ บทความนี้จะแนะนำวิธีการสังเคราะห์ GLP ที่รู้จักกันในปัจจุบันอย่างเป็นระบบ-1
วิธีที่ 1 การสังเคราะห์เฟสของแข็ง:
การสังเคราะห์ด้วยเฟสของแข็งเป็นวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการสังเคราะห์เปปไทด์และโปรตีน และยังใช้กันทั่วไปสำหรับการสังเคราะห์ GLP-1 ในการสังเคราะห์แบบโซลิดเฟส โครงสร้างหลักจะเกิดขึ้นจากการเชื่อมโยงกรดอะมิโนตัวแรกเข้ากับเรซิน ถัดไป กรดอะมิโนถัดไปจะถูกเติมตามลำดับและทำปฏิกิริยาทางเคมีกับสารควบแน่นที่เหมาะสม ในที่สุด สามารถรับผลิตภัณฑ์เป้าหมายได้โดยการตัดโพลีเปปไทด์ออกจากเรซิน
ความสำคัญของการสังเคราะห์ในเฟสของแข็งคือการช่วยให้ระบบอัตโนมัติและการผลิตเปปไทด์ในปริมาณมากได้ วิธีการสังเคราะห์โซลิดเฟสกระแสหลักในปัจจุบัน ได้แก่ Fmoc และ Boc ในหมู่พวกเขา วิธี Fmoc ใช้กลุ่มปกป้อง N-Fmoc เพื่อปกป้องเปปไทด์ ในขณะที่วิธี Boc ใช้ tert-butyloxycarbonyl เพื่อปกป้องกลุ่มคาร์บอกซิล
วิธีที่สอง การสังเคราะห์เฟสของเหลว:
การสังเคราะห์ในเฟสของเหลวเป็นวิธีการดั้งเดิมของการสังเคราะห์เปปไทด์ ซึ่งสารตั้งต้นจะถูกวางไว้ในเฟสของเหลวสำหรับปฏิกิริยา ข้อได้เปรียบของการสังเคราะห์ในเฟสของเหลวคือสภาวะของปฏิกิริยาไม่รุนแรงและเหมาะสำหรับการดัดแปลงโครงสร้างทางเคมีที่ละเอียดอ่อน อย่างไรก็ตาม เนื่องจากมีสารตั้งต้นมากเกินไป กระบวนการทำให้บริสุทธิ์จึงค่อนข้างยุ่งยาก ปฏิกิริยาเคมีในการสังเคราะห์เฟสของเหลวประกอบด้วย:
1. ปฏิกิริยาการควบแน่น:
ปฏิกิริยาการควบแน่นเป็นหนึ่งในปฏิกิริยาพื้นฐานที่สุดในการสังเคราะห์เปปไทด์ กล่าวคือ กลุ่มคาร์บอกซิลที่เริ่มต้นโดยสารควบแน่น เช่น DCC และ HOBt จะเชื่อมต่อกับกลุ่มอะมิโนของกรดอะมิโนผ่านปฏิกิริยาอะซิเลชัน สภาวะการเกิดปฏิกิริยาไม่รุนแรงและผลผลิตสูง
2. ปฏิกิริยาการกำจัด:
ปฏิกิริยาการกำจัดคือการรีดิวซ์เมไธโอนีนให้เป็นไดไทออลโดย NaBH4 และตัวรีดิวซ์อื่นๆ ทำให้มันไม่ทำงาน ปฏิกิริยาจะต้องดำเนินการภายใต้สภาวะพื้นฐาน
3. การกำจัดกลุ่มปกป้อง:
เนื่องจากหน้าที่ที่แตกต่างกันของกรดอะมิโนในสายโซ่เปปไทด์ กลุ่มปกป้องที่แตกต่างกันจะถูกใช้เพื่อการป้องกัน หลังจากการสังเคราะห์เสร็จสิ้น จำเป็นต้องถอดกลุ่มปกป้องออก สำหรับวิธี Fmoc มักใช้ไพเพอริดีนเพื่อกำจัด Fmoc ในขณะที่วิธี Boc จะใช้ TFA เพื่อลบ Boc
วิธีที่สาม การสังเคราะห์ทางเคมี:
GLP-1 เป็นฮอร์โมนโพลีเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพที่สำคัญ การสังเคราะห์สามารถรับรู้ได้ด้วยวิธีการต่างๆ ซึ่งการสังเคราะห์ทางเคมีเป็นหนึ่งในวิธีการที่ใช้บ่อยที่สุด ข้อดีของการสังเคราะห์ทางเคมีคือสามารถผลิตผลิตภัณฑ์เป้าหมายที่มีความบริสุทธิ์สูง ซึ่งเหมาะสำหรับการผลิตขนาดใหญ่ วิธีการสังเคราะห์ทางเคมีและขั้นตอนโดยละเอียดของ GLP-1 จะแนะนำด้านล่าง
1. เส้นทางสังเคราะห์และการป้องกันการเลือกกลุ่ม:
โมเลกุล GLP-1 ประกอบด้วยกรดอะมิโน 36 ชนิด รวมทั้งกรดอะมิโนชนิด L 21 ชนิด และชนิด D 15 ชนิด ก่อนดำเนินการสังเคราะห์ จำเป็นต้องเลือกเส้นทางสังเคราะห์ที่เหมาะสมและเลือกกลุ่มปกป้องที่สอดคล้องตามเงื่อนไขการสังเคราะห์ การสังเคราะห์ Fmoc solid-phase มักใช้สำหรับการสังเคราะห์ขนาดใหญ่โดยอัตโนมัติ วิธีนี้ใช้ N-9-fluoroimido carboxyl protection (N-Fmoc) เป็นกลุ่มปกป้อง และต้องเลือกกลุ่มปกป้องทุติยภูมิที่เหมาะสม (เช่น tert-butyl หรือ methyl) เพื่อให้แน่ใจว่ามีการป้องกันเฉพาะตำแหน่ง ในแต่ละครั้งที่มีการเพิ่มกรดอะมิโนใหม่ กลุ่มที่ปกป้อง Fmoc จะต้องถูกกำจัดออกก่อน แล้วจึงเติมสารคู่ควบที่ป้องกันของกรดอะมิโนถัดไป
2. การสังเคราะห์ลำดับกรดอะมิโนหลัก:
ลำดับหลักของ GLP-1 ประกอบด้วยกรดอะมิโน 21 ตัว รวมถึงซีรีนที่สำคัญและลำดับไดเปปไทด์ของกรดโพรลิล-กลูตามิกสี่ตัว ในการสังเคราะห์แบบโซลิดเฟส การสังเคราะห์ลำดับแกนสามารถแบ่งออกเป็นขั้นตอนต่อไปนี้:
2.1. เติมกรดอะซิติกคาร์บาเมต (Fmoc-NH-CH2CO2Et) และ 2-Cl-Trt-Cl ลงในเรซินสังเคราะห์เฟสของแข็ง และทำปฏิกิริยาการควบแน่นด้วยสารเชื่อมต่อ DIC/NMM
2.2. ลบกลุ่มป้องกัน Fmoc โดยยกเลิกปฏิกิริยาของกลุ่ม
2.3. เพิ่มกรดอะมิโนถัดไป ทำซ้ำขั้นตอนที่ 1 และขั้นตอนที่ 2 ตามลำดับจนกว่าจะมีการสังเคราะห์ลำดับแกนกลาง
2.4. การก่อตัวของโครงสร้างเพนทาเปปไทด์บนเรซินเฟสของแข็ง เติมสารรีเอเจนต์อะซิตาไลเซชันลงในเรซินโซลิดเฟส ทำปฏิกิริยากับสารจดจำที่ปลาย N (เช่น HBTU) เพิ่มกลุ่มป้องกันโซ่ด้านข้างของซีรีนเป็นสารรีดิวซ์เสริม จากนั้นนำกลุ่มป้องกัน Fmoc ออก
2.5. ภายใต้การเร่งปฏิกิริยาของ Bacillus subtilis transferase (ProTide) โครงสร้าง pentapeptide จะเกิดปฏิกิริยาแลกเปลี่ยนกับสารตั้งต้นของ serine iodoacetate
3. การสังเคราะห์ลำดับกรดอะมิโนที่เหลือ:
หลังจากเสร็จสิ้นการสังเคราะห์ลำดับแกนกลางแล้ว จำเป็นต้องเติมกรดอะมิโนที่เหลือต่อไป รวมถึงกรดอะมิโนชนิด L และ D การเติมกรดอะมิโนเหล่านี้จำเป็นต้องเริ่มจากลำดับแกนกลาง เติมกรดอะมิโนถัดไปในลำดับ และใช้สารควบแน่นที่สอดคล้องกันเพื่อดำเนินปฏิกิริยาเคมีจนกว่าจะมีการสังเคราะห์โมเลกุลโพลีเปปไทด์ GLP-1 ที่สมบูรณ์ ในระหว่างกระบวนการนี้ ยังจำเป็นต้องเลือกกลุ่มปกป้องที่เหมาะสมตามที่ต้องการ และดำเนินการตามขั้นตอนของปฏิกิริยา การกำจัดกลุ่มปกป้อง และการเติมกรดอะมิโนตามลำดับ
4. การบำบัดด้วยโซเดียมไฮดรอกไซด์:
หลังจากเติมกรดอะมิโนทั้งหมดแล้ว สายโซ่เพปไทด์ที่สังเคราะห์ได้ไม่สมบูรณ์จะก่อตัวขึ้นบนเรซินโซลิดเฟส และจำเป็นต้องผ่านกระบวนการเพื่อสร้างโมเลกุลเปปไทด์ที่ก่อตัวขึ้นอย่างสมบูรณ์ ประการแรก เปปไทด์ที่ไม่ขึ้นรูปควรถูกไฮโดรไลซ์ด้วยโซเดียมไฮดรอกไซด์ เพื่อให้กลุ่มคาร์บอกซิลที่ปลาย C เดิมที่ติดอยู่กับเรซินนั้นหลุดออกจากเรซิน และกลุ่มป้องกันจะถูกแยกออกในน้ำ หลังจากเกิดปฏิกิริยาไฮโดรไลซิส จะได้ผลิตภัณฑ์เป้าหมาย
5. การตกตะกอนและการชะล้าง:
หลังการบำบัด สารละลายไฮโดรไลซ์จะถูกบำบัดด้วยกรดเพื่อทำให้ผลิตภัณฑ์เป้าหมายตกตะกอน จากนั้น เม็ดจะถูกแขวนลอยในน้ำอีกครั้ง ตามด้วยการล้างอย่างเข้มข้นเพื่อขจัดสิ่งเจือปน
6. การทำให้บริสุทธิ์:
ขั้นตอนสุดท้ายคือการทำให้ผลิตภัณฑ์ที่ต้องการบริสุทธิ์ โดยปกติจะใช้โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง ในระหว่างกระบวนการนี้ สามารถระบุความบริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ได้โดยการตรวจจับจุดสูงสุดของสารละลายในสเปกตรัมมวล กล่าวโดยย่อ การสังเคราะห์ทางเคมีของ GLP-1 ต้องใช้ปฏิกิริยาที่ซับซ้อนหลายรอบและกระบวนการทำให้บริสุทธิ์อย่างเข้มงวดเพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์เป้าหมายที่ใช้งานอยู่
วิธีที่สี่ การสังเคราะห์ทางชีวภาพ:
GLP-1 เป็นฮอร์โมนโพลีเปปไทด์สำคัญที่มีผลทางสรีรวิทยาต่างๆ รวมถึงส่งเสริมการหลั่งอินซูลิน ระงับความอยากอาหาร ลดน้ำหนักตัวและรักษาความไวของอินซูลิน เป็นต้น วิธีการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ GLP-1 ส่วนใหญ่สังเคราะห์โดยเซลล์ L ในต่อมตับอ่อน และอัตราการสังเคราะห์จะถูกควบคุมโดยการบริโภคอาหาร โดยมีการแนะนำขั้นตอนโดยละเอียดดังนี้
1. การเตรียมงานก่อนการสังเคราะห์:
ก่อนการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ GLP-1 จำเป็นต้องมีการเตรียมการบางอย่าง ซึ่งรวมถึงการระบุประเภทเซลล์ที่ใช้ การตั้งค่าเงื่อนไขในการเพาะเลี้ยง และการเลือกเอนไซม์เร่งปฏิกิริยาที่เหมาะสม เซลล์ L เป็นแหล่งที่มาหลักของการสังเคราะห์ GLP-1 เนื่องจากมีสารตั้งต้นของฮอร์โมน 2 ชนิด ได้แก่ GIP (เปปไทด์ที่มีลักษณะคล้ายกลูคากอน 1) และ GLP-1 สามารถแยกเซลล์ L ได้จากเยื่อบุผิวในลำไส้ของกระต่ายหรือหนู ก่อนการสังเคราะห์ทางชีวภาพ จำเป็นต้องเพาะเลี้ยงเซลล์ให้มีจำนวนเพียงพอ และควรจัดหาสารอาหารที่เพียงพอและสภาวะที่เหมาะสมในการเพาะเลี้ยง นอกจากนี้ยังจำเป็นต้องเลือกเอนไซม์เร่งปฏิกิริยาที่เหมาะสมเพื่อส่งเสริมปฏิกิริยา
2. การสังเคราะห์และการประมวลผลสารตั้งต้น:
การสังเคราะห์ทางชีวภาพของ GLP-1 ส่วนใหญ่เกิดขึ้นในเซลล์ L และสารตั้งต้นประกอบด้วยฮอร์โมน 2 ชนิด ได้แก่ GIP และ GLP-1 หลังจากเข้าสู่เซลล์ต่อมไร้ท่อแล้ว GIP และ GLP-1 จะถูกประมวลผลโดยเอนไซม์ย่อยโปรตีนและแยกออกเป็นเปปไทด์แต่ละตัว ชุดของเอนไซม์และปัจจัยร่วมมีส่วนร่วมในกระบวนการนี้ รวมถึงสารตั้งต้นโพลีเปปไทด์แอซิเดส (PC2), ไอโซเมอเรส และปัจจัยการยึดเกาะปลาย
3. การแปลงร่วมกันระหว่างส่วนของโพลีเปปไทด์:
หลังการประมวลผล เปปไทด์ GIP และ GLP-1 จะรวมกันอีกครั้งเพื่อสร้างโพลีเปปไทด์ GLP-1 กระบวนการนี้ต้องใช้เปปไทด์ที่มีลักษณะคล้ายกลูคากอน 1 (GLP-1) เป็นแม่แบบซึ่งเปปไทด์แต่ละตัวอื่นๆ จะรวมกันเพื่อสร้างโพลีเปปไทด์เชิงประกอบใหม่ กระบวนการนี้ยังต้องการเอนไซม์และปัจจัยเฉพาะบางอย่าง เช่น Prohormone Convertase 1/3 (PC1/3) และ Carboxypeptidase E (CPE)
4. การหลั่ง GLP-1:
หลังจากสังเคราะห์และประมวลผล GLP-1 แล้ว มันจะถูกเก็บไว้ในไซโตพลาสซึมและตุ่มภายในของเซลล์ต่อมไร้ท่อ เมื่อถูกกระตุ้นด้วยอาหาร เซลล์ต่อมไร้ท่อจะปล่อย GLP-1 และเข้าสู่การไหลเวียนของโลหิตผ่านทางหลอดเลือดขนาดเล็ก กระบวนการนี้ได้รับการควบคุมและควบคุมผ่านชุดของเส้นทางการส่งสัญญาณ รวมถึง cAMP-Ca2 บวกและอื่น ๆ
กล่าวโดยย่อ การสังเคราะห์ทางชีวภาพของ GLP-1 เกี่ยวข้องกับการดำเนินการร่วมกันของการเชื่อมโยงและปัจจัยต่างๆ การผสมผสานระหว่างการสังเคราะห์ทางชีวภาพและการสังเคราะห์ทางเคมีสามารถเป็นรากฐานที่ดีขึ้นและสนับสนุนการวิจัยและการผลิต GLP-1
วิธีที่ห้า การสังเคราะห์ด้วยเอนไซม์:
การสังเคราะห์ด้วยเอนไซม์คือการสังเคราะห์สายโซ่เปปไทด์ผ่านการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ทางชีวภาพ เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการสังเคราะห์เฟสของเหลวแบบดั้งเดิม การสังเคราะห์ด้วยเอนไซม์สามารถทำได้ที่อุณหภูมิห้อง และสามารถเลือกวัตถุดิบได้หลากหลาย เอนไซม์ เช่น theta-liquid synthase, AEP, ACE เป็นต้น มักใช้เพื่อกระตุ้นการสังเคราะห์
โดยสรุป วิธีการที่กล่าวถึงข้างต้นเป็นวิธีการที่เป็นไปได้สำหรับการสังเคราะห์ GLP-1 วิธีการต่างๆ เหมาะสำหรับสภาวะการทดลองและสภาพแวดล้อมการผลิตยาที่แตกต่างกัน